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Unchained Labs Big Lunatic
KinEXA:分子和细胞相互作用仪
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SapidyneInstruments Inc. 1995年在美国创立产品基于独特的Kinetic Exclusion AssayKinExA®)专利技术。KinExA分析三维水平及游离状态相互作用,不固定任何分子、不会对平衡带来影响、没有质量迁移的限制、可以检测未纯化样品和完整细胞;因此具有极宽范围内的生物分子、生物结构及完整细胞灵活分析范围。最新型号KinExA 4000可以检测细胞(天然的和工程化的)、非纯化样品、血清样品,小分子等的相互作用和亲和力。四个颗粒储存器可容纳四种不同的固相剂,并可与多达270个样品一起支持长时间的无人值守操作,KinExA能够测量生理相关条件下的相互作用

KinExA的应用:

应用一、KinExA在CAR-T细胞治疗中的应用

因多种因素的限制,自体CAR-T细胞治疗产品可能在应用于患者前未必能够进行全部项目的检定,所以工艺验证非常重要。工艺研究及验证必须结合工艺的实际情况设定相应的验证参数,CAR-T细胞产品工艺研究在不断发展,到目前为止,业界对何种工艺最好并未达成共识。因此,可以在产品研发过程及早期临床试验阶段开展不同程度的工艺验证研究,工艺验证完成后,应在关键工艺步骤设置关键过程控制参数及标准,以提高CAR-T细胞产品的生产一致性。

CAR-T细胞治疗产品的质量控制研究及检测项目一般应包括:细胞数量及其存活率、细胞表型、CAR阳性率检测、生物学效力检测,无菌检测、支原体、热原/内毒素的检测、CAR-T细胞中病毒载体拷贝数及整合的检测等。如果能够检测CAR-T细胞与抗原分子的亲和力,以及CAR-T细胞上抗体的表达量,无疑会提升CAR-T细胞的质量控制标准。

目前市面上除了KinExA技术外,没有其他特别有效的方式检测完整细胞与分子间的亲和力,更无从判断细胞上分子的表达量。KinExA技术可以检测细胞与分子间的亲和力,并且可以计算细胞上分子的表达量。其检测原理如下图,先将梯度稀释的细胞与恒定浓度的分子共同孵育达到平衡,离心之后收集上清液(此时上清液中只存在游离的分子),再通过已提前包被过的珠子捕获游离的分子,用荧光标签的抗体检测游离分子的量,通过检测器检测得到相应的数值后,利用KinExA系统软件进行数据分析。

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下图是国内某知名CAR-T公司通过KinExA技术检测CAR-T细胞与抗原分子间相互作用的结果。

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结果表明,CAR-T细胞与抗原的亲和力Kd为45.41pM,T细胞表面CAR的表达水平为1.368e+5,Kd与EL的95%置信区间均较窄,数据非常准确可信。

应用二、KinExA在高亲和力检测上应用

对于抗肿瘤药市场,目前精准医疗最为成熟的领域还是以靶向药物为代表的抗肿瘤药物。由于单克隆抗体类抗癌药的副作用较小,且靶向性更好,因此,单抗药物仍将是引领抗肿瘤药物发展最为重要的领域。以PD-1为靶点的一类单抗药呈现出较高的亲和力,常规的相互作用检测系统例如SPR 、BLI、ITC等由于自身原理的限制均不能检测高亲和力(pM级别)。KinExA技术有别于常规的相互作用检测系统,能准确有效的检测高亲和力(fM级别)。

下表是Pfizer, Rinat两家公司联合发表的KinExA高亲和力检测范围的文章。

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Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

案例分析

案例一:完整细胞的相互作用检测

背景:单克隆抗体XMetA是胰岛素受体(IR)变构部分的激动剂,其激活代谢Akt激酶信号通路,而对有丝分裂胞外信号调节激酶(ERK)信号通路几乎没有影响。为了研究这种选择性信号通路的性质,作者验证了XMetA对CHO细胞中IR,Akt和ERK的特异性磷酸化和活化的影响。

目的:完整细胞亲和力检测。

方法:研究者将表达短链型(IR-A)及长链型(IR-B)胰岛素受体的不同浓度CHO细胞分别与XMetA孵育,通过离心获得游离的XMetA,用KinExA仪器检测亲和力。另外,作者采取同样的策略,用KinExA仪器检测胰岛素与CHO细胞表面IR-A,IR-B的亲和力。


结论:XMetA与IR-A亚型的亲和力为55±16pM,与IR-B亚型的亲和力为50±11pM。另外,在对照抗体组,胰岛素与IR-A亚型的亲和力为156±14pM;在XMetA组,胰岛素与IR-A亚型的亲和力为216±100pM;在对照抗体组,胰岛素与IR-B亚型的亲和力为221±28pM;在XMetA组,胰岛素与IR-B亚型的亲和力为277±112pM。数据同时说明, XMetA与IR亚型的结合与胰岛素无关。

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Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling

selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

案例二:细胞与上清未纯化样品检测

背景:单克隆抗体(mAb)在体内与膜蛋白间亲和力的可靠评估是肿瘤治疗的主要问题。在BV展示系统中,膜蛋白能以天然状态在病毒表面展示。

目的:细胞与上清中未纯化样品亲和力检测。

方法:研究者基于KinExA技术,结合杆状病毒(BV)膜蛋白展示系统,描述了一个简单而高度敏感的单克隆抗体评估方法。

结论:在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上(BV beads),其KD值(~10pM)与全细胞分析方法一致(R2=0.998),表明基于KinExA技术检测方法提供了针对细胞表面蛋白的单克隆抗体亲和力准确的评估。

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Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem.

案例三:高亲和力检测

背景:白细胞介素-1β(IL-1β)是炎症反应的有效介质,在许多淋巴细胞的分化中发挥调控作用。在一些炎症和自身免疫性疾病中,血清中IL-1β水平与疾病的发展和严重程度相关。 IL-1β在一些疾病中的机理已经被临床试验证实,并获得FDA的审批。

目的:高亲和力检测与验证。

方法:设计抗IL-1β抗体XOM052,SPR检测其与IL-1β的亲和力为≤4pM。另外实验采用Protein A捕获IL-1β抗体,解离10min,发现时间不足以使抗体抗原发生解离,将解离时间延长至4h,解离早期无法准确拟合,推测是由于IL-1β抗体从Protein A上解离对实验造成的影响。为了更精确的计算亲和力,作者改用KinExA,分析得到其亲和力为300fM。

结论:KinExA技术对于高亲和力的检测具有无可替代的优势。

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Owyang A.M., et al. 2011. XOMA 052, a potent, high-affinity monoclonal antibody for the treatment of IL-1B-mediated diseases. mAbs 3(1): 49-60.


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