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N-糖基化对于IgG1稳定性的影响

N-糖基化对于IgG1稳定性的影响

N-糖基化是IgG重链Fc片段的天冬酰胺残基的糖基化,位于CH2区的Asn297

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N-糖基化是调节Fc效应器功能的关键因素,影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)等功能。

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N-糖基化是影响mAb生物治疗药物安全性、有效性和稳定性的最关键质量属性(CQA)之一。

糖链的长度、分叉型式和单糖序列的变化导致了糖基化修饰的复杂性,下图是部分商品化单抗不同糖型及其相对丰度:

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N-糖基化对蛋白质稳定性、DMPK和免疫原性的影响密切相关:

·       缺失聚糖可能导致蛋白质聚集,增加血清对药物的清除率;

·       蛋白质变性可以暴露免疫表位以诱导抗药抗体,导致血清半衰期缩短;

·       聚糖结合蛋白介导的T细胞活化可以促进不良免疫应答和蛋白质快速清除。

然而,哺乳动物细胞在培养过程中产生的单抗不可避免的会异质性糖基化,因此无法确定单一特定糖基化的影响

下面这篇文章,是由来自Astellas Pharm和横滨市立大学的科学家发表,文中对单一糖型对于IgG1功能和稳定性的影响进行了研究:

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首先,使用伏见制药独特的酶工程技术产生具有高度均一性且可定义的N-糖基化IgG

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N糖基化示意图

糖基化类型分为两组,对照组是具有核心α-1,6-岩藻糖基化的IgG1,另一组为添加Kifunensine后产生非岩藻糖基化的高甘露糖IgG1

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含岩藻糖和无岩藻糖的两组糖基化样品

分别用内源荧光FSDSC检测CH2结构域的相转变温度Tm,结果表明去糖基化的糖型GLcNAc-Fuc和末端甘露糖糖基化的糖型HMGlcNacTm值降低:

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内源荧光法和DSC法检测不同糖基化IgG1Tm

DSC得到的CH2结构域的Tm1值与内源荧光得到的Tm1的相关系数为0.98

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内源荧光法和DSC法检测不同糖基化IgG1Tm

检测升温过程SLS(静态光散射)的变化,末端半乳糖基化的糖型显示出最高的Tagg(聚集起始温度):

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不同糖基化IgG1Tagg

进行短期强制降解研究,以评估65°C持续7小时后的聚集倾向,SLS(静态光散射)实时监测分析:

地图上有字描述已自动生成

等温稳定性实验,65°C7hSLS266nm

在对所有糖类进行孵育后,肉眼观察到浑浊的溶液,SLS信号达到最大值后下降是由于蛋白质样品的沉淀。

评估聚集体形成的速度,计算达到最高SLS信号水平的2%10%50%所需的时间:

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等温稳定性结果分析

JMP分析表明,去岩藻糖基化和末端唾液酸化明显加快了团聚体的形成速度,而末端半乳糖基化明显降低了团聚体的形成速度:

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糖基化类型对于聚集影响的JMP分析

在此之前的研究表明,异质性糖型式很难清楚地阐明每种糖型的作用,本文是第一篇精确评估核岩藻糖基化,末端半乳糖基化的复合双三元糖形式对IgG1热稳定性的研究,其中特定的N糖基化抗体的详细信息,将有助于后续的单抗开发。

本文使用了伏见制药的独特的酶工程技术,技术路线示意图如下:

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另外,本文使用了Unchained LabsUnit检测TmTagg和进行等温稳定性实验。

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Unit仪器上通过荧光方法得到的Tm值和DSC得到的Tm1值,具有很强的相关性:

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内源荧光和DSCTm结果的相关性

荧光法与DSC方法相比,具有通量高,时间短,蛋白浓度范围广,微量上样等优点,下面是来自Genentech的用户评价:

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在得到Tm值的同时,无需额外样品或实验,即可以同时得到Tagg值:

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UncleUnit的升级版本,可以实现Unit的全部功能,加入的DLS模块,更加全面表征稳定性,本文作者所在的Astellas Pharma已在2018年成为Uncle的用户:

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安斯泰来制药集团(Astellas Pharma Inc.)是在20054月由原来日本的山之内制药株式会社与藤泽制药株式会社合并而成。是一家总部位于日本东京的研发型制药企业。在PharmExec(美国制药经理人杂志)公布的2019年全球制药企业50强名单,位列日本第2,全球第23

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Unchained Labs是目前全球唯一一家只专注于提供蛋白稳定性分析和制剂开发创新工具和仪器的公司,总部位于美国加州普莱森顿(Pleasanton, CA),致力于蛋白稳定性表征和及制剂开发优化的最新解决方案。