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针对GPCR靶点的抗体亲和力测定方案

作者:师要辉


一、GPCR简介
GPCR( Guanosine-binding Protein Coupled Receptor)中文名称为G蛋白偶联受体,是一种膜蛋白受体。GPCR作为细胞信号传导中的重要蛋白,其共同点是其蛋白体结构中都有七个跨膜结构。研究显示GPCR参与了很多细胞信号转导过程,当膜外的配体作用于该受体时,该受体的膜内部分与G蛋白发生结合,从而激活G蛋白。G蛋白可通过两种途径传递细胞外的信息:第一种方式是打开跨膜离子通道,让外界的离子进入;第二种方式是激活第二信使,如:cAMp、IP3/DAG等。简单来讲,GPCR能结合细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路,最终引起细胞状态和功能的改变,同时参与多种生命活动以及内分泌与代谢等多种生理过程。从疾病方面来看,GPCR也与糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫疾病等重要疾病的发生、发展及治疗密切相关。

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随着科研和生物医药领域发展的不断深入,GPCR的重要性也愈发显现,为了表彰在这一领域的贡献,2012年诺贝尔化学奖授予了两位美国科学家:罗伯特·莱夫科维茨(Robert J. Lefkowitz)和布莱恩·科比尔卡(Brian K. Kobilka),他们因“G蛋白偶联受体”研究领域的杰出贡献而获奖。从生物医疗领域的数据来看,大约40%的现代药物都以GPCR作为靶点。而至少有三分之一的小分子药物是GPCR的激活剂或者拮抗剂,在畅销药物排行中就有众多药物属于GPCR相关药物,比如:充血性心力衰竭药物Coreg、高血压药物Cozaar、乳腺癌药物Zoladex等,而还有更多这样的候选药物小分子在临床研发中。


2014年以来批准上市的针对GPCR的产品

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正在研发的针对GPCR的产品

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针对GPCR的分类,主流有两种方法:一是A-F分类系统,面向所有生物体内的GPCR蛋白;第二种是将GPCR蛋白被分为Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2这5类。按照第二种分类标准来看,Rhodopsin受体类是GPCR家族中最大的一类,而其下还分为多种亚家族。而整个Rhodopsin家族包含各种重要受体,如组胺受体、多巴胺受体、大麻素受体、内皮素受体、催产素受体等。而其它类GPCR也包含众多受体种类,如钙敏感受体、甜味味觉受体等。

二、GPRC单抗药物开发
现阶段,作为开发药物靶点的受体约370个,分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族内。这些GPCR主要与生理代谢和疾病的形成有关,包括癌症、炎症、感染、代谢疾病等。药物作用于GPCR靶点,其主要的作用是阻断或激活胞外信号对靶点的激活,调控由靶点介导的胞内信号传导以及阻断病毒通过靶点侵入。作用于GPCR受体的药物可以是小分子药物或抗体类药物,相对于小分子药物,单克隆抗体药物治疗GPCR相关疾病拥有多方面优势。抗体在体内的清除率更低,作用时间更长;并且在给定剂量下,抗体的血浆浓度的个体差异更小。另一方面在药物开发方面,对于一些受体,小分子药物通过高通量筛选阶段的阳性率很低,成药难度大。此外单抗药物可以具有对受体更高的特异性以及避免一些小分子要会带来的副作用,如小分子药物可以穿过血脑屏障引起药副作用。现针对GPCR受体,用于治疗癌症、炎症和感染的很多抗体药物已经进入临床或上市,而更多的其它抗体药物正在加紧研发的过程中。

三、GPCR靶点的抗体药物研发中亲和力测定面临的问题
现GPCR抗原主要形式有: GPCR全长蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop区域、带有膜蛋白的细胞膜碎片、过表达GPCR的细胞、带有GPCR的脂质体、带有GPCR的类病毒颗粒等。各种方法各有特点,现就其存在的问题做一个简单描述。

全长GPCR作为抗原的优势在于比较纯净且相对接近天然构象,但困难在于获得了全长蛋白后其原包裹在细胞膜内的疏水域也暴露在外,这样容易筛到结合跨膜区的抗体。同时由于疏水域暴露在外,蛋白也容易发生聚集影响正确抗体的形成。对于合成胞外N端或loop区制作抗原的方法相对简单,但它们可能无法模拟蛋白的全部天然构象,表位容易遗漏和失真。带有膜蛋白的细胞膜碎片和过表达GPCR的细胞由于目标GPCR在整个膜上含量比例很低,因此会给筛选带来很高的背景从而影响最后结果。脂质体和类病毒颗粒作为GPCR蛋白的载体可以有效降低筛选背景,是现在效果较好的方法之一,但由于脂质体的不稳定性,导致在在应用时有无法忽视的局限。

由于GPCR结构的特殊性,针对GPCR的抗体的研发遇到了很多挑战。
一方面是获取合适的GPCR作为抗原比较困难。引起免疫反应的抗原的稳定性、单一性、期望产生抗体结合的位点是否外露、不期望产生抗体结合的部分是否被包裹都非常重要。另一方面,由于多次跨膜的特性,使用传统的方法测定GPCR与抗体的亲和力比较困难。纯化的GPCR作为受体与抗体相互作用,无论使用全长GPCR,还是片段GPCR都无法真实模拟天然构象,因此测的的亲和力可能与真实值有较大偏差。理想的测定,应该是使用表达全长GPCR的完整细胞作为抗原,与相应的抗体相互作用。


四、KinExA应用于GPCR靶点抗体的亲和力测定方案


KinExA系统的检测原理
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通常,测定亲和力使用BLI或SPR原理,通过在芯片上固定一个分子,另一个分子流经芯片表面,从而测定相互作用,这就带来了显著的缺点:固定在芯片上的生物分子可能不能维持其天然构象、质量迁移影响动力学分析、被检测分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物结构有分子量上限限制、样品需要纯化,以及无法检测完整细胞。

相反,KinExA分析三位水平及游离状态相互作用,不固定任何分子,不会对平衡带来任何影响,没有质量迁移,可以检测未纯化样品和完整细胞。因此,KinExA可以非常方便的应用于GPCR靶点的抗体亲和力的分析。

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