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针对GPCR靶点的抗体亲和力测定方案作者:师要辉 一、GPCR简介 GPCR( Guanosine-binding Protein Coupled Receptor)中文名称为G蛋白偶联受体,是一种膜蛋白受体。GPCR作为细胞信号传导中的重要蛋白,其共同点是其蛋白体结构中都有七个跨膜结构。研究显示GPCR参与了很多细胞信号转导过程,当膜外的配体作用于该受体时,该受体的膜内部分与G蛋白发生结合,从而激活G蛋白。G蛋白可通过两种途径传递细胞外的信息:第一种方式是打开跨膜离子通道,让外界的离子进入;第二种方式是激活第二信使,如:cAMp、IP3/DAG等。简单来讲,GPCR能结合细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路,最终引起细胞状态和功能的改变,同时参与多种生命活动以及内分泌与代谢等多种生理过程。从疾病方面来看,GPCR也与糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫疾病等重要疾病的发生、发展及治疗密切相关。 ![]() 2014年以来批准上市的针对GPCR的产品 正在研发的针对GPCR的产品 针对GPCR的分类,主流有两种方法:一是A-F分类系统,面向所有生物体内的GPCR蛋白;第二种是将GPCR蛋白被分为Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2这5类。按照第二种分类标准来看,Rhodopsin受体类是GPCR家族中最大的一类,而其下还分为多种亚家族。而整个Rhodopsin家族包含各种重要受体,如组胺受体、多巴胺受体、大麻素受体、内皮素受体、催产素受体等。而其它类GPCR也包含众多受体种类,如钙敏感受体、甜味味觉受体等。 全长GPCR作为抗原的优势在于比较纯净且相对接近天然构象,但困难在于获得了全长蛋白后其原包裹在细胞膜内的疏水域也暴露在外,这样容易筛到结合跨膜区的抗体。同时由于疏水域暴露在外,蛋白也容易发生聚集影响正确抗体的形成。对于合成胞外N端或loop区制作抗原的方法相对简单,但它们可能无法模拟蛋白的全部天然构象,表位容易遗漏和失真。带有膜蛋白的细胞膜碎片和过表达GPCR的细胞由于目标GPCR在整个膜上含量比例很低,因此会给筛选带来很高的背景从而影响最后结果。脂质体和类病毒颗粒作为GPCR蛋白的载体可以有效降低筛选背景,是现在效果较好的方法之一,但由于脂质体的不稳定性,导致在在应用时有无法忽视的局限。 四、KinExA应用于GPCR靶点抗体的亲和力测定方案 KinExA系统的检测原理 ![]() 通常,测定亲和力使用BLI或SPR原理,通过在芯片上固定一个分子,另一个分子流经芯片表面,从而测定相互作用,这就带来了显著的缺点:固定在芯片上的生物分子可能不能维持其天然构象、质量迁移影响动力学分析、被检测分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物结构有分子量上限限制、样品需要纯化,以及无法检测完整细胞。 相反,KinExA分析三位水平及游离状态相互作用,不固定任何分子,不会对平衡带来任何影响,没有质量迁移,可以检测未纯化样品和完整细胞。因此,KinExA可以非常方便的应用于GPCR靶点的抗体亲和力的分析。 关于KinExA产品和应用,如果您感兴趣,欢迎通过电话13918897495或扫描下方二维码与我们联系,或者通过邮件yh_ibio@163.com索取资料! |